三種蛋白測定方法與標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合

一、蛋白濃度測定的常見方法

1、考馬斯亮藍(lán)G250法測定蛋白濃度（bradford法）

1）實(shí)驗(yàn)原理

考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)濃度，是利用蛋白質(zhì)―染料結(jié)合的原理，定量的測定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法。考馬斯亮藍(lán)G－250存在著兩種不同的顏色形式，紅色和藍(lán)色。它和蛋白質(zhì)通過范德華力結(jié)合，在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)和染料結(jié)合符合比爾定律（Beer’s law）。此染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后顏色有紅色形式和藍(lán)色形式，zui大光吸收由465nm變成595nm，通過測定595nm吸光度可測定蛋白質(zhì)的含量。另外，反應(yīng)體系中呈現(xiàn)的顏色變化主要是G-250分子間疏水相互作用形成的聚集體聚集程度不同引起的。單體形式表現(xiàn)為藍(lán)色，單體和聚集體共存時(shí)表現(xiàn)為綠色，全為聚集體形式呈現(xiàn)為棕紅色。影響因素主要為溶液體系中磷酸、乙醇、NaCl的含量。

蛋白質(zhì)和染料結(jié)合是一個(gè)很快的過程，約2min即可反應(yīng)*，呈現(xiàn)zui大光吸收，并可穩(wěn)定1h，之后，蛋白質(zhì)―染料復(fù)合物發(fā)生聚合并沉淀出來。蛋白質(zhì)―染料復(fù)合物具有很高的消光系數(shù)，使得在測定蛋白質(zhì)濃度時(shí)靈敏度很高，在測定溶液中含蛋白質(zhì)5µL/mL時(shí)就有0.275光吸收值的變化，比Lowry法靈敏4倍，測定范圍為10－100µg蛋白質(zhì)，微量測定法測定范圍是1－10µg蛋白質(zhì)。此反應(yīng)重復(fù)性好，度高，線性關(guān)系好。

2）優(yōu)缺點(diǎn)

此方法干擾物少，研究表明：NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，（NH4）2SO4無干擾。強(qiáng)堿緩沖液在測定中有一些顏色干擾，這可以用適當(dāng)?shù)木彌_液對(duì)照扣除其影響。Tris，乙酸，2―巰基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污劑如Triton X-100，SDS，玻璃去污劑有少量顏色干擾，用適當(dāng)?shù)木彌_液對(duì)照很容易除掉。但是，大量去污劑的存在對(duì)顏色影響太大而不易消除。

標(biāo)準(zhǔn)曲線在蛋白質(zhì)濃度較大時(shí)稍有彎曲，這是由于染料本身的兩種顏色形式光譜有重疊，試劑背景值隨更多染料與蛋白質(zhì)結(jié)合而不斷降低，但直線彎曲程度很輕，不影響測定。

3）試劑

①考馬斯亮藍(lán)G250溶液：100mg考馬斯亮藍(lán)G250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，用蒸餾水稀釋至1000ml，濾紙過濾即可。

②標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液：純的牛血清血蛋白(BSA)，預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，根據(jù)其純度同0.15mol/L NaCl配制成1mg/ml蛋白溶液。

3）實(shí)驗(yàn)步驟

①繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

搖勻，1h內(nèi)以0號(hào)管為空白對(duì)照，在595nm處比色。

②未知樣品蛋白質(zhì)濃度測定

取合適的未知樣品體積，使其測定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線范圍內(nèi)。根據(jù)所測定的A595nm值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白的量，從而計(jì)算出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）。

2、BCA法測量蛋白質(zhì)濃度

1）實(shí)驗(yàn)原理

BCA檢測法是Lowry測定法的一種改進(jìn)方法。蛋白質(zhì)分子中的肽鍵在堿性條件下能與Cu2+絡(luò)合生成絡(luò)合物，同時(shí)將Cu2+還原成Cu+。二喹啉甲酸及其鈉鹽是一種溶于水的化合物，在堿性條件下，可以和Cu+結(jié)合生成深紫色的化合物，這種穩(wěn)定的化合物在562nm處具有強(qiáng)吸收值，并且化合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比。故可用比色的方法確定蛋白質(zhì)的含量。

2）優(yōu)缺點(diǎn)

與Lowery法相比，BCA蛋白測定方法靈敏度高，操作簡單，試劑及其形成的顏色復(fù)合物穩(wěn)定性俱佳，并且受干擾物質(zhì)影響小。與Bradford法相比，BCA法的顯著優(yōu)點(diǎn)是不受去垢劑的影響。BCA法蛋白質(zhì)濃度檢測范圍為10-2000 µg/ml。檢測0.5~10 µg/ml微量蛋白時(shí)應(yīng)采用濃縮試劑，并需要在60ºC反應(yīng)。

但BCA法在樣品含有脂類物質(zhì)時(shí)將明顯提高光吸收值。蛋白樣品中EDTA或葡萄糖濃度大于10 mM不能使用BCA方法。

3）試劑

①BCA試劑的配制

試劑A（1L）：分別稱取10g BCA (1%)，20g Na2CO3·H2O (2%)，1.6g Na2C4H4O6·2H2O(0.16%)，4g NaOH (0.4%) ，9.5g NaHCO3 (0.95) ，加水至1L，用NaOH或固體NaHCO3調(diào)節(jié)pH值至11.25。

試劑B（50ml）：取2g CuSO4·5H2O (4%)，加蒸餾水至50ml。

BCA試劑：取50份試劑A與1份試劑B混合均勻。此試劑可穩(wěn)定一周。

②標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：稱取40mg牛血清白蛋白，溶于蒸餾水中并定容至100ml，制成400μg/ml的溶液。

4）實(shí)驗(yàn)步驟

①繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（略）。

②試劑加完后，混勻，于37℃保溫30min，冷卻至室溫后，以0號(hào)管為對(duì)照，在562nm處比色。

③未知樣品蛋白質(zhì)濃度測定

3、紫外吸收法

1）實(shí)驗(yàn)原理

大多數(shù)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中含有芳香族氨基酸（*和*）殘基，使蛋白質(zhì)在280nm的紫外光區(qū)產(chǎn)生zui大光吸收。當(dāng)入射光、吸光系數(shù)和溶液的光徑長度L不變時(shí)，這一波長范圍內(nèi)的吸光值與蛋白質(zhì)濃度成正比，利用這一特性可定量測定蛋白質(zhì)的含量。

2）優(yōu)缺點(diǎn)

此操作簡便，測定迅速，低濃度鹽類不干擾測定。但只適合測試較純凈、成分相對(duì)單一的蛋白質(zhì)，容易受到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾；此外，此方法敏感度較低，要求蛋白的濃度較高（0.1-0.5mg/ml）。且玻璃器皿會(huì)吸收紫外線，需要石英等特殊材料器具。

3）試劑

①標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：配制2mg/ml的酪蛋白溶液。

②樣品溶液

4）實(shí)驗(yàn)步驟

①繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（略）

②測定未知樣品溶液

5）結(jié)果分析

根據(jù)樣品溶液的光密度值，在繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖中查出樣品溶液的蛋白質(zhì)含量。

此外，紫外吸收法也可以不制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，直接測280nm的OD值，然后通過OD值與校正系數(shù)直接求得未知蛋白的濃度。

上述三種方法在測定吸光值時(shí)，既可以使用紫外分光光度儀、酶標(biāo)儀，甚至也可以使用Nanodrop微量計(jì)。它們所需要的樣品量逐漸減少，所以制作標(biāo)曲時(shí)不同儀器加入的試劑量也不盡相同，需要具體分析。

二、利用Excel軟件擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線

1、將標(biāo)準(zhǔn)蛋白測得的OD值及對(duì)應(yīng)的濃度輸入Excel表格中，并求出重復(fù)測量的平均值。

2、將0ug/ml對(duì)照管的OD值減去，進(jìn)行背景校正。

3、將標(biāo)準(zhǔn)濃度和對(duì)應(yīng)的校正值轉(zhuǎn)變?yōu)榱小＃◤?fù)制，選擇性黏貼，轉(zhuǎn)置）

4、選中校正值和濃度的數(shù)值，然后找到excel工具欄“插入”，在下拉窗口中選擇“散點(diǎn)圖”圖標(biāo)，并選擇不帶曲線的散點(diǎn)圖。

5、在彈出的“標(biāo)準(zhǔn)曲線”圖中，找到任意一個(gè)“散點(diǎn)”，右擊該點(diǎn)，在彈出的菜單中選擇“添加趨勢線”。

6、接著會(huì)彈出一個(gè)參數(shù)選擇窗口，在該窗口中選擇“線性”趨勢線，并勾選”顯示公式“、”顯示R平方值“。

7、不同的Excel版本，略微有些區(qū)別，選定參數(shù)后，點(diǎn)擊“確定“。即可得到完整的標(biāo)準(zhǔn)曲線。一般R平方值≥0.99，即說明該擬合曲線可以使用。

8、將測得的未知蛋白OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式”y = 1316.5x – 3.6272“中，即可求得未知蛋白的濃度。