PCR操作范例及反應體系的組成

一、 PCR 操作范例 在一個典型的 PCR 反應體系中需加入：適宜的緩沖液、微量的模板 DNA 、 4 × dNTPs 、耐熱性多聚酶、 Mg 2 和兩個合成的 DNA 引物。模板 DNa 94 ℃變性 1min ，引物與模板 40 ～ 60 ℃退火 1min ， 72 ℃延伸 2min 。在循環前模板預變性 3 ～ 5min ；在末次循環后，樣品仍需繼續延伸 3 ～ 5min 以上，確保擴增的 DNA 為雙鏈 DNA 。為便于了解 PCR 反應中各成份的組成，加入量和反應條件，使人們以此為基礎，對不同的研究對象逐項改變來找到反應條件，特列舉 Perkin Elmer Cetus 公司 Gene Amp DNA 試劑盒提供的典型反應條件供參考。  
表 22-1 PCR 反應混合液  
 

的總濃度為 0.8mmol/L ，低于 1.5mmol/L 的 Mg 2 濃度。因此，在高濃度 DNA 及 dNTP 條件時，必須相應調整 Mg 2 的濃度。 2 ． Tris -HCl 緩沖液在 PCR 中使用 10 ～ 50mmol/L 的 Tris – HCl 緩沖液，很少使用其他類型的緩沖液。 Tris 緩沖液是一種雙極化的離子緩沖液， pKa 為 8.3(20 ℃ ), △ pKa 為 0.021/ ℃。因此， 20mmol/l Tris pH8.3(20 ℃ ) 時，在典型的熱循環條件下，真正的 pH 值在 7.8 ～ 6.8 之間。  
3 ． KCl 濃度 K 濃度在 50mmol/L 時能促進引物退火。但現在的研究表明， NaCl 濃度在 50mmol/L 時， KCl 濃度高于 50mmol/L 將會抑制 Taq 酶的活性，少加或不加 KCl 對 PCR 結果沒有太大影響。  
4 ．明膠明膠和 BSA 或非離子型去垢劑具有穩定酶的作用。一般用量為 100 μ g/ml ，但現在的研究表明，加或不加都能得到良好和 PCR 結果，影響不大。  
5 ．二甲基亞砜（ DMSO ）　　在使用 Klenow 片段進行 PCR 時 DMSO 是有用的；加入 10%DM － SO 有利于減少 DNA 的二級結構，使（ G C ） % 含量高的模板易于*變性，在反應體系中加入 DMSO 使 PCR 產物直接測序更易進行，但超過 10% 時會抑制 Taq DNA 聚合酶的活性，因此，大多數并不使用 DMSO 。  
 
二、四種脫氧三磷酸核苷酸（ 4 × dNTPs ）  
在 PCR 反體系中 dNTP 終濃度高于 50mmol/L 會抑制 Taq 酶的活性，使用低濃度 dNTP 可以減少在非靶位置啟動和延伸時核苷酸錯誤摻入，高濃度 dNTPs 易產生錯誤摻入，而濃度太低，勢必降低反應物的產量。 PCR 常用的濃度為 50 ～ 200 μ mol/L ，不能低于 10 ～ 15 μ mol/L 。四種 dNTP 的濃度應相同，其中任何一種濃度偏高或偏低，都會誘導聚合酶的錯誤摻入，降低合成速度，過早終止反應。  
決定zui低 dNTP 濃度的因素是靶序列 DNA 的長度和組成，例如，在 100 μ l 反應體系中， 4 × dNTPs 濃度若用 20 μ mol/L ，基本滿足合成 2.6 μ g DNA 或 10pmol 的 400bp 序列。 50 μ mol/L 的 4 × dNTPs 可以合成 6.6 μ g DNA, 而 200 μ mol/L 足以合成 25 μ g/DNA 。  
購自廠商的 dNTP 溶液一般均未調 pH ，應用 1mol/l NaOH 將 dNTP 貯存液 pH 調至 7.0 ，以保證反應的 pH 值不低于 7.1 。市購的游離核苷酸凍 干粉，溶解后要用 NaOH 中和，再用紫外分光光度計定量。  
 
三、引物的量  
引物在 PCR 反應中的濃度一般在 0.1 ～ 1 μ mol/L 之間。濃度過高易形成引物二聚體且產生非特異性產物。一般來說用低濃度引物經濟、特異，但濃度過低，不足以完成! 
 
DNA 形成結合物，在紫外燈下能發射熒光，使 EB 的熒光強度增強 80 ～ 100 倍，所以，電泳后凝膠在紫外燈下可直接觀察。一般肉眼觀察 DNA 量可達 10ng ，其熒光強度與 DNA 含量成正比。 
  
30 個循環的擴增反應，則會降低 PCR 的產率。  
 
四、Taq DNA 聚合酶的量  
　　典型 PCR 反應混合物中，所用酶濃度為 2.5U/ μ l ，常用范圍為 1 ～ 4U/100 μ l 。由于 DNA 模板的不同和引物不同，以及其它條件的差異，多聚酶的用量亦有差異，酶量過多會導致非特異產物的增加。  
　　由于生產廠家所用兵配方、制造條件以及活性定義不同，不同廠商供應的 Taq DNA 聚合酶性能也有所不同。  
Cetus 公司酶定義是： 1 個酶單位是指在以下分析條件下，于 74 ℃， 30min 內使 10nmmol 的 dNTP 摻入酸不溶性成分所需的酶。測定時間為 10min ，折算成 30min 摻入量。  
　　分析條件為 25nmol/L TAPS （三羥基 - 甲基 - 氨基丙烷磺酸鈉 pH9.3,25 ℃） ,50mmol/l KCl, 2mmol/L MgCl 2 ,1mmol/L β -ME （巰基乙醇）， dATP 、 dTTP 、 dGTP 各 200mmol/L ， dCTP 為 100mmol/L( 由不標記及α - 32 P 標記混合 ) ， 12. μ g 變性鯡魚 DNA ，zui終體積 50 μ l 。  
 
五、模板  
　　單、雙鏈 DNA 或 RNA 都可以作為 PCR 的樣品。若起始材料是 RNA ，須先通過逆轉錄得到*條 cDNA 。雖然 PCR 可以僅用極微量的樣品，甚至是來自單一細胞的 DNA ，但為了保證反應的特異性，還應用 ng 級的克隆 DNA ，μ g 水平的單拷貝染色體 DNA 或 10 4 拷貝的待擴增片段作為起始材料，模板可以是粗品，但不能混有任何蛋白酶、核酸酶、 Taq DNA 聚合酶抑制劑以及能結合 DNA 的蛋白。  
DNA 的大小并不是關鍵的因素，但當使用*分子量的 DNA （如基因組的 DNA 時），如用超聲處理或用切點罕見的限制酶（如 Sal 1 和 Not 1 ）先行消化，則擴增效果更好。閉環靶序列 DNA 的擴增效率略低于線狀 DNA ，因此，用質粒作反應模板時先將其線狀化。  
　　模板靶序列的濃度因情況而異，往往非實驗人員所控制，實驗可按已知靶序列量逆減的方式（ 1ng,0.1ng,0.001ng 等），設置一組對照反應，以檢測擴增反應的靈敏度是否符合要求。  
 
六、石蠟油  
PCR 擴增時建議在混合物上面鋪一層石蠟油，減少 PCR 過程中尤其是變性時液體蒸發所造成的產物的丟失。研究表明，應用石蠟油可使擴增產量增加 5 倍，可能與石蠟油維持熱恒定和整個反應體系中鹽濃度有關。  
 
 
 
電泳分析  
　　在實際工作中常采用瓊脂糖凝膠電泳。一般情況下先在電泳緩沖液或凝膠中加 1% 溴化乙錠（ EB ）（每 100ml 加 100 μ l ），然后將已經制備好的 1% ～ 2% 瓊脂糖凝膠（用電泳緩沖液配制）放入電泳槽內，加入待測樣品 10 μ l ，同時用分子量標準品作標記。瓊脂糖濃度應按分離 DNA 片段的大小進行選擇，一般用 1.5% ～ 2% ，電泳電壓 75V ，待樣品進行凝膠內距膠末端 1cm 時，切斷電源，取出凝膠在紫外燈下直接觀察結果。  
　　由于溴化乙錠可與雙鏈  
 
DNA 形成結合物，在紫外燈下能發射熒光，使 EB 的熒光強度增強 80 ～ 100 倍，所以，電泳后凝膠在紫外燈下可直接觀察。一般肉眼觀察 DNA 量可達 10ng ，其熒光強度與 DNA 含量成正比。  
DNA 分子在凝膠中泳動速度決定于電荷效應及分子效應。前者由所帶凈電荷量決定，而后者與分子大小及構型有關。按照 DNA 分子大小，其凝膠濃度可做不同的調整。有條件的實驗室也可用聚丙烯酰胺凝膠電泳（ PAGE ）分析擴增的 DNA 片段。  

表 22-2 電泳檢測擴增結果， EB 熒光顯色（ 254nm ）