小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)原代培養實驗 

實驗步驟
一、取得小鼠胚胎

1.  性成熟母小鼠與種公鼠按1公（♂）:2母（♀）比例合籠。

2.  每天早上觀察母小鼠口。有乳白色或蛋黃色凍膠狀物(栓)即確定為懷孕。見栓當天上午定為懷孕的0.5d。

3.  取懷孕12.5～14.5 d母鼠，斷頸處死，無菌條件下暴露子宮。

4.  用鑷子提起近子宮頸端，分離子宮系膜，剪斷子宮角。


5.  取出整個子宮，置于有PBS的平皿內。用PBS洗滌三次，棄除表面殘余血跡。

6.  沿子宮系膜側剪開子宮，取出帶有胎膜的胚胎，置于另一盛有PBS的平皿內，充分洗滌，棄除表面紅細胞。

7. 用小鑷子撕破胎膜，取出胎鼠，棄除胎膜，用PBS洗滌三次。

8. 去除胚胎頭部、內臟和四肢，將軀干部置于另一盛有PBS的平皿內，用PBS至少洗滌三次，充分棄除紅細胞。

二、取得小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）

1.  用無菌眼科小剪刀或刮胡刀片將鼠胚軀干剪(切)成1mm3以下的碎塊，吸置于離心管內。

2.  加適量*，將離心管置于培養箱中10-20分鐘

3.  取出離心管，反復吹打，加足量培養液終止消化。

4.  離心1000轉，5分鐘。

5.  棄掉上清，加適量培養液，反復吹打20次。

6. 分裝到T75中，一般每2個胚胎可以制成一個T75的原代細胞。

7. 置37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱培養。

8.  待細胞長3-7天細胞互相重疊爬滿整個培養瓶底時即可1：3-1：6傳代。

9.  吸棄培養液上清。

10. PBS（不含鈣鎂）沖洗兩次。

11.  加0.25%*-0.02EDT消化。

12.  在顯微鏡下觀察，當少量細胞漂浮，貼壁的細胞層出現裂隙時，用移液管吹打沖洗瓶底5-6次。

13.  即刻加MEF培養液終止消化。

14. 1000轉，5分鐘離心。吸棄上清。

15.  加足培養液，吹打制成單細胞懸液，分裝到各T75中。完成傳代。

16.  原代細胞中還有少量組織塊未被充分消化，在以后的每次傳代過程中要盡量制成單細胞懸液，組織塊會逐漸消失。

17.  原代細胞中混有一些雜細胞，一般傳到第3代時，雜細胞逐漸減少。小鼠胚胎成纖維細胞為梭狀；但連成片時，細胞互相交聯，形態不典型。

三、MEF的凍存

1.  當細胞 90%-100% 融合時，尤其細胞少量堆聚可冷凍。

2.  處理方法同二的9-14，每75 cm2 的細胞 加3 ml 凍存液重懸細胞。

3. 每個凍存管編號加1 ml細胞懸液。

4. 置入程序降溫盒-80℃過夜，放入液氮長期保存。

四、滅活MEF制備飼養層細胞

1.  取新的培養瓶，加0.1% Gelatin溶液覆蓋預處理30分鐘，用前吸掉Gelatin溶液。

2.  取需要處理的MEF細胞，以10ug/ml濃度加（Mitomycin C）混勻。

3.  置培養箱中3小時。

4.  吸棄廢液。

5.  用DPBS洗5遍。

6.  處理方法同二11-14。

7.  處理過的MEF加適量培養液重懸計數，以3.0×104/ cm2（MEF）鋪在Gelatin處理過的培養瓶上。

8.  置培養箱中靜置過夜，使其貼壁。

9.  鋪好的飼養層在1-7天內有效，都可以支持mES生長并維持其性