植物材料RNA的3種提取方法

實驗步驟

1. 利用RNeasy Plant Mini Kit提取總RNA

    1) 于1.5 ml離心管中加入0.5 ml RLT緩沖液和5ul β-巰基乙醇；

    2) 稱取約100 mg材料，液氮研磨后轉移到提取液中，渦旋混勻，56℃，2 min；

    3) 加入紫色柱子，23℃， 12000 rpm，離心2 min；

    4) 濾液轉入一新的1.5 ml離心管中，加入1/2體積的無水乙醇，用槍頭混勻，移入粉色柱子，23℃， 12000 rpm，離心15 sec；

    5) 棄濾液，加入700 ul RW 1，23℃，12000 rpm，離心15 sec；

    6) 將柱子移入一新的2 ml收集管，加入500 ul RPE，23℃， 12000 rpm，離心15 sec；

    7) 棄濾液，加入500ul RPE，23℃， 12000 rpm，離心2 min；

    8) 加20 ul DEPC處理過的水，室溫靜置15 min，23℃，12000 rpm，離心1 min；

    9) 再分別加入40 ul和20ul DEPC處理過的水，室溫靜置15 min，23℃，12000 rpm離心1 min；

    10) 合并三次收集的RNA，取2ul電泳檢測純度和質量。-20℃短時間保存，或-80℃長期保存。

2. 利用TRIZOL試劑盒提取RNA

    1) 于1.5 ml離心管中加入1 ml TRIZOL提取液；

    2) 稱取約100 mg液氮研磨后的材料，轉移到提取液中，混勻，2-8℃，≤12000 g離心10-15 min；

    3) 取上清，于15-30℃放置5min，加0.2 ml，劇烈搖動15 sec， 15-30℃放置2-3min，2-80C， ≤12000 g，離心15 min；

    4) 取水相，加等體積異丙醇，15-30℃放置10 min，2-8℃，<12000 g，離心10 min；

    5) 用75%乙醇洗滌沉淀，2-8℃，<7500g離心5 min;用DEPC處理的水溶解RNA，-20℃短時間保存，或-80℃長期保存。

3. CTAB法提取植物總RNA

    1) 50 ml離心管中加入15 ml CTAB提取緩沖液(需加入300ul β-巰基乙醇)，65℃預熱；

    2) 稱2-3 g新鮮的植物材料，在液氮中充分研磨成粉末；

    3) 樣品轉入50 ml離心管中，迅速震蕩混勻至無成團結塊，65℃溫浴10 min，再加入15 ml，混勻；

    4) 室溫下，10000 rpm，離心15 min，上層水相移入一個新的離心管，加入等體積的，混勻后再抽提一次；

    5) 將上層水相轉入另一離心管中，加入 8M的LiCl，使終濃度為2M(約加入水相的 1/3)，4℃，過夜；

    6) 4℃，12000 rpm，離心20 min沉淀RNA棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀，晾干；

    7) 加入500ul SSTE溶解沉淀，轉移至1.5 ml離心管中，加入等體積酸性酚/后混勻；

    8) 室溫下，13000 rpm，離心10 min，將上層水相轉移至另一1.5 ml離心管中，加入等體積的后混勻；

    9) 室溫下，13000 rpm，離心10 min，上層水相轉移至新管中，加入1/10體積的3M NaAC和2倍體積無水乙醇，-80℃靜置30 min；

    10) 4℃，13000 rpm，離心20 min，70%乙醇洗滌沉淀，烘干后加入50 ul DEPC處理H₂0溶解RNA，取1ul電泳檢測，-80℃保存備用。

4. RNA的純化

    1) DEPC水處理的1.5 ml離心管中加入：45ul  RNA，7.5ul l0XDnase Assay Buffer，20U RNase inhibitor 1.5ul Dnase I，混合液于37℃溫浴30 min；

    2) 用DEPC-H₂0將溶液體積調至250ul，加1/10體積的3 M NaAC(pH 5.2)和2倍體積冷的無水乙醇，混勻，-20℃放置30 min；

    3) 4℃，12000 rpm，離心20 min，沉淀RNA；

    4) -20℃預冷的70%乙醇洗一次，-20℃預冷的100%乙醇洗一次；

    5) 干燥后，用20 ul DEPC處理的H₂O溶解，-20℃保存。