單層培養(yǎng)傳代步驟

絕大多數(shù)有限細(xì)胞系及連續(xù)細(xì)胞系在體外進(jìn)行原代培養(yǎng)時都是貼壁生長的，培養(yǎng)的細(xì)胞一經(jīng)接觸培養(yǎng)基質(zhì)就迅速鋪展并開始有絲分裂，逐漸形成致密的細(xì)胞單層，這種培養(yǎng)方式稱為單層細(xì)胞培養(yǎng)。

單層培養(yǎng)的細(xì)胞系在進(jìn)行原代培養(yǎng)時，隨著培養(yǎng)時間的延長和細(xì)胞的不斷分裂，一則細(xì)胞之間相互接觸而發(fā)生接觸抑制，生長速度減慢甚至停止；另一方面由于營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡、代謝廢棄物不斷積累，導(dǎo)致細(xì)胞停止生長甚至死亡。此時，為獲得大量的、穩(wěn)定的同種細(xì)胞，并保證細(xì)胞始終維持快速生長，可以將單層細(xì)胞從培養(yǎng)基質(zhì)上分離下來制成單細(xì)胞懸液，按照推薦濃度接種到若干個新的培養(yǎng)器皿內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，這個過程就稱為傳代（Passage）或再培養(yǎng)（Subculture）。

單層細(xì)胞傳代培養(yǎng)，需要將細(xì)胞間及細(xì)胞與培養(yǎng)基質(zhì)之間的連接打斷。對于某一些松散貼壁的細(xì)胞類型，只需輕敲培養(yǎng)器皿側(cè)面，細(xì)胞就會脫離下來。絕大多數(shù)貼壁細(xì)胞需要使用蛋白水解酶例如，trypsin/EDTA消化破壞上述連接。還有少數(shù)細(xì)胞需要使用機(jī)械力，例如使用細(xì)胞刮，使細(xì)胞分離下來。對單層培養(yǎng)而言，細(xì)胞生長接近指數(shù)生長期末時（大約70%-90%匯合），即可進(jìn)行傳代。一般生長穩(wěn)定的細(xì)胞4~7天傳代一次。

單層培養(yǎng)傳代步驟：

1. 事先將培養(yǎng)基、Trypsin-EDTA溶液、Trypsin中和液、DPBS在室溫平衡，并準(zhǔn)備若干已包被好poly-L-lysine或Fibronectin等的培養(yǎng)器皿。

注：不推薦使用37℃水浴鍋對上述溶液進(jìn)行平衡。

2. 將長滿細(xì)胞的培養(yǎng)器皿中原有培養(yǎng)液吸棄，DPBS洗滌細(xì)胞1-2次。

3. 加入適量（略蓋過細(xì)胞即可）Trypsin-EDTA溶液室溫孵育0.5-2 min，不定時在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，直至約80%細(xì)胞收縮、變圓突起（round up），立即加入等體積Trypsin中和液終止消化。

注：不同類型細(xì)胞消化時間長短不一，消化時間需自行摸索。

4. 輕輕晃動培養(yǎng)容器使細(xì)胞脫離，并將消化下來的細(xì)胞收集、轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)。另取適量*培養(yǎng)基潤洗培養(yǎng)容器，將殘留的細(xì)胞一并轉(zhuǎn)移至離心管。

注：細(xì)胞收集完畢后，可以在顯微鏡下觀察培養(yǎng)容器內(nèi)還有多少細(xì)胞殘留（通常應(yīng)少于5%），以此判斷細(xì)胞收獲是否*。 

5. 將收獲的細(xì)胞懸液于1000rpm下離心5min，棄上清，然后用適量*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

6. 計數(shù)細(xì)胞，然后根據(jù)推薦的接種密度重新接種到新的已包被好的培養(yǎng)皿內(nèi)。將培養(yǎng)器皿置于37℃, 5% CO2/95% air培養(yǎng)箱培養(yǎng)，視細(xì)胞生長情況，每隔2-3天換一次液，詳見datasheet。

注：有限細(xì)胞系的增殖速率較低，其原代培養(yǎng)通常以1:1，1:2或1:3的比例進(jìn)行傳代，但是對于增殖速率很高的連續(xù)細(xì)胞系（或無限細(xì)胞系），通常要以更高的比例進(jìn)行傳代。